基于非热大气压等离子处理进行的骨整合增强和生物净化
纳米结构钛的制备

by Yuhao Zeng 1,*, Satoshi Komasa 1 [OrcID] , Hisataka Nishida 2, Akinori Agariguchi 1, Tohru Sekino 2 [OrcID] and Joji Okazaki 1

Int. J. Mol. Sci.2020, 21(10), 3533; https://doi.org/10.3390/ijms21103533

摘要

碱处理具有纳米网络结构（TNS）的钛酸酯层是一个有希望用于提高植入物中骨整合能力的表面，不过存在对生物 膜污染的抵抗力不足而失败的风险。这项研究目的在于- 在重新建立促进新骨的表面时测试使用手持式非热等离子 体设备在不破坏表面纳米结构的情况下是否可以有效消除生物膜污染。

研究使用压电直接放电（PDD）等离子体发生器处理TNS 标本。利用金黄色葡萄球菌评估去污效果。评价初始细胞 附着粘附图像，碱性磷酸酶活性，细胞外基质使用大鼠骨髓进行矿化和与成骨相关的基因，使用大鼠股骨模型在体内评估间充质干细胞和骨反应。

纳米形貌和表面粗糙度在等离子体处理之前和之后没有显著不同。

等离子处理TNS 改善了细胞和骨形成的活动。此外等离子处理有效地消除了表面的生物膜污染。这些结果表明，这种等离子体处理是在植入前进行即时处理纳米材料的和治疗种植体周围炎有前途的方法。

关键词：种植体周围炎症； 骨整合 生物膜抑制； 非热等离子体处理；碱处理钛 纳米孔网络结构

1. 简介

钛是骨科和牙科植入物最普遍使用的材料之一，因为具有出色的机械性能，耐腐蚀性和生物相容性[1,2]。不过，钛植入物的使用受到植入物周围感染风险的限制，拖延骨整合时间，并且骨传导特性不足，特别是在骨质疏松症患者中[3]。
钛基植入物的临床长期成功率在10 年和16 年随访期后分别为89.23％和82.94％ [4]。需要进一步提高临床长期成功率植入物，促进早期骨整合，骨-植入物界面的长期稳定性，并且需要减少种植体周围炎[2,5,6]。
植入物表面的物理和化学特性在植入物周围的早期骨形成中起着至关重要的作用[7]。

由于钝化氧化层的敏感性及其导电性，植入物表面修改 – 例如喷砂[8]，酸蚀[9]，氧化[10]，和磷酸钙沉积（单独或组合）[11,12] 在过去的三十年中使用来改变表面的粗糙度，微米和纳米级形态特征，以及植入物表面化学成分。这些改变可以赋予高水平的生物相容性并促进早期植入物周围的骨形成[13-15]。

我们之前的研究表明，在高浓度碱金属作用下，均匀的亲水性钛酸钠层在钛表面会生成纳米网络结构（TNS）治疗[16]。与Ti 相比，TNS 具有更高的粗糙度和亲水性，因此与蛋白质和细胞附着以及羟基磷灰石的形成更相容；这些多种因素导致优异的成骨活性[17]。
不过仍然必须解决一些在其临床应用之前的挑战，更具体地说具有纳米结构的碱处理钛仍然对细菌附着和生物膜形成的抵抗力不足，最终可能引起种植体周围炎[18]，早期仍需要骨整合植入。

等离子体是物质的四个基本状态之一，被定义为中性离子气体, 由具有永久相互作用的粒子组成，包括光子，电子，正负离子，原子，自由基以及受激或未受激分子。等离子在大气压下可以通过多种技术获得（例如，射频（RF）等离子体[19]，介电屏障），放电（DBD）等离子体[20]，电晕放电等离子体[21]，滑行电弧放电等离子体[22,23]。
由于产生了活性氧和氮（RONS），等离子体处理具有用于去除污染物并赋予植入物表面亲水性，从而使植入物表面促进蛋白质和细胞粘附[24,25]。根据Lee 等人的说法，等离子处理通过植入物表面清除碳来减少细菌附着，从而降低植入物的风险感染[26]。
等离子体处理产生的活性氧和氮RONS 在不破坏植入物复杂的表面几何形状的情况下可以净化和抑制生物膜，在植入物表面重新定植，同时也促进成骨细胞的附着和分化[23,25,27,28]。等离子处理是无毒，低温，安全而且具有较高的治疗效率，使其比其他灭菌方法更适合临床应用。
使用手持式非热大气等离子体利用压电技术的装置最近已集中在医学应用上。因为它与紫外线，激光和其他类型的光相比，具有更高的加工效率并且对环境更友好。在等离子处理方面，非热大气等离子手持设备非常方便在植入前进行即时处理和治疗。同时，这种非热大气等离子体消除生物膜，同时重新建立有助于骨骼再生的表面特性，特别适合于种植体周围炎症的治疗[29]。

在目前的研究中，我们假设非热大气等离子体处理可以改变植入物表面上的化学成分并保留纳米结构的粗糙度通过碱处理建立的表面，从而促进骨整合和去污。为了证明这一假设，我们研究了等离子体处理对生物膜形成的影响，体内和体外植入初期的细胞黏附和骨整合实验。金黄色葡萄球菌被用来体现等离子处理的效果。
TNS 的等离子体处理有效地改变了TNS 样品表面的化学成分，进一步改善了植入物的亲水性并促进了细胞附着和成骨分化，同时净化生物膜而不破坏TNS 表面纳米形态。等离子具有潜在的临床应用，例如立即治疗植入前和种植体周围炎的治疗方法。

2. 结果

2.1. 表面特征

扫描电子显微镜（SEM）为观察纳米形态的表征做出了重大贡献，用于调查TNS 和等离子TNS 样品的表面形貌。扫描电镜显微照片显示，纳米孔网络结构钛表面经过碱处理后的平均直径为50–100 nm，相互连接良好且均一。
如图1 所示，样品表面的纳米孔结构等离子处理后没有明显变化。在TNS 和TNS 样品等离子表面处理的效果由原子力显微镜（AFM）显示（图1）此外，测得的表面粗糙度（Ra 和Rz）值AFM 的分析表明，TNS 和等离子TNS样品之间没有显著差异（表格1）。
TNS 和等离子TNS 样品表面的亲水性分析表明，TNS 表面表现出亲水性接触角约为9 度，值得注意的是，接触角后在等离子处理的TNS 样品表面上润湿性的显著变化为<3 度，表现出超亲水特性（图1E）。

TNS 和等离子TNS 表面的化学成分和化学键通过 XPS – X 射线光电能量频谱检测，标本的广泛调查光谱显示表面化学成分包含 钛，氧， 碳，氮和钠的峰值。进一步分析经过等离子处理之后的化学成分和化学键的变化，获得了高能量的C1s, O1s,N1s 和Ti2p。Ti2p3/2 和Ti2p1/2 各自显示在458.5eV 和464.2eV，5.7eV 自旋轨道分裂值与Ti4+ 价态一致。 TNS 和等离子TNS 上Na1s 的光谱没有显著的差异，意味着两种样品类型都被钛覆盖，这和之前按的研究[30] 发现是一致的。所有表面上都有碳的污染是明显而易见的，这也和之前的发现一致。明显的，等离子处理之后样品表面上碳的比例大大的下降了， 图2 显示了两种表面上N/Ti 到O/Ti 的比例，这个比例指示O 和N 在等离子处理过的表面上显著的提高了。

图2 F 显示的是之前的和等离子处理之后的高能量光谱N1s 峰值。等离子处理的样品观察到了独特的光谱,显示结合能量在406.8eV, 即对应的NOx（硝酸盐）种类[32,33]. 相反的，未进行等离子处理的样品表面少见这样的光谱。
Figure 2 也显示了在TN 和等离子处理TNS 表面上高分辨的氧1s 光谱。
根据Moulder 等人 [32]，反卷积O1s 峰值揭示了三个不同的氧原子状态。 结合能值530.3eV 的成分（O1）对应于TiO2 晶格结构中的氧O2- ; 531.4 eV（O2）通常与-OH 基团相关； 532.7 eV（O3）处的成分通常与NOx 或H2O 组[34]。

TNS 表面的XPS 光谱显示大多数氧以氧化物(O1)的形式结合，-OH 键的比例较小(Figure 2G)。这基本意味在样品表面氧原子更有可能形成TiO2。 和TNS 表面相反的是，等离子TNS 表面上观察到更大量的O2 成分。这些与-OH 基团有关，是由等离子和材料表面之间的高能活性氧相互作用引起的。 结果是，材料表面亲水性显著的改善了，这与接触角测量结果一致。 重要的O3 成分通常与在等离子TNS 样品的表面检测到NOx 基团相关； 这是由于在等离子处理过程中反应性氮物种（RNS）主导着气相化学反应[35,36]。

2.2. 去除生物膜污染

为了评估等离子处理对金黄色葡萄球菌的去污效率将金黄色葡萄球菌（S. aureus）培养物在TNS 表面孵育24 小时，然后发展成生物膜。将表面暴露于等离子体处理。 灭活的结果表明等离子处理可以会大大降低金黄色葡萄球菌的生存能力（Figure 3）。

2.3. 细胞内活性氧的测定(ROS)

此外，如图4 所示，TNS 表面的细胞内ROS 水平为温育24 小时后，显着高于血浆TNS 样品的表面，而两种类型的
表面之间粘附细胞的数量没有显著差异。

2.4. 细胞粘附和形态

24 小时后，使用鬼笔环肽和DAPI 进行的细胞形态学染色显示粘附在等离子体处理过的表面上的细胞比在未处理表面具有更大的细胞粘附面积（Figure 5A–E）。 根据亲水性分析结果，初始细胞粘附的增加和细胞形态的变化受助于等离子体处理产生的表面超亲水性[37]。 此外，CellTiter-Blue®细胞活力化验用于评估大鼠骨髓间充质干细胞（rBMMSCs）与TNS 和等离子TNS 样品的粘附。 结果表明，1、3 和6 小时有更多的细胞粘附在等离子TNS 样品的表面（ Figure 5F）。

2.5. 大鼠骨髓间充质干细胞（rBMMSCs）的成骨活性

ALP 活性是早期成骨细胞活性和细胞表型的生化标志，与TNS 组相比，等离子TNS 中细胞分化和骨形成的阶段在第7 天和第14 天更高（Figure 6A），等离子TNS 组在21 天和28 天时显示出更高的钙沉积（细胞外基质矿化的标志）（Figure 6B）。 骨形态发生蛋白（BMP）和骨钙蛋白（OCN）的基因表示，这是具有代表性的成骨分化产物，生长的细胞中在等离子TNS 上培养比在TNS 样品上明显更高（Figure 6C,D）。 这些结果表明等离子处理可显著促进rBMMSCs 的分化活性。

2.6. 体内植入物周围骨形态发生的评估

使用大鼠股骨模型评估在TNS 植入物和等离子处理的TNS 植入物周围的骨形成活动。
在等离子TNS 的表面区域观察到更多的 小梁 微结构 (Figure 7), 此外总量的骨量比例(BV/TV), 即小梁的数量平均值(Tb.N)，也即小梁的厚度平均值(Tb.Th)，在等离子TNS 的样品中非常显著的更高，这意味着等离子处理植入体在促进成骨活性(p<0.01)。等离子处理TNS 植入物的小梁分离度较低(Tb.Sp) (p<0.01)。

此外，使用纵断面评估植入物周围的新骨形成。如图8 所示，在等离子TNS 植入物周围观察到新形成的骨头比TNS 植入物更多。定量组织形态分析表明，等离子TNS 植入物周围的骨面积（BA）和骨植入物接触（BIC）显著高于一般TNS 植入物周围（图8E，F）。此外，植入物周围新形成的骨头是在第1 周用盐酸土霉素（蓝色）标记，在第4 周用茜素红S（红色）标记，以及钙黄绿素（绿色）在第八周标记。植入物界面和标记物之间的标记骨骼区域，等离子TNS 植入物在第1、4 和8 周的骨面积明显高于未处理TNS 植入物（图8G–I）。

3. 讨论

钛纳米结构表面的表面形态和化学组成在模仿天然骨骼组织和软组织以促进骨骼愈合过程中起着至关重要的作用，在文献中已被广泛报道[15]。根据我们之前的实验，碱处理在钛表面形成均匀的纳米孔结构增强了骨整合，与之相比具有出色的亲水性和粗糙度纯钛[16,17]。然而，纳米结构表面对生物膜的抵抗力仍然不足，可能会导致种植体周围炎，更迅速地是骨整合，这仍然是植入初期的要求。在本研究中，非热大气高压等离子体被用来改变纳米结构表面，并促进了全面评估成骨活性和去污能力。

根据SEM 和AFM 观察到的纳米形貌，样品表面显示出无论是否经过等离子体处理，均质纳米多孔结构均相似，这表明等离子体处理不会破坏样品表面纳米结构的几何形状，并且从而可以保持纳米结构对骨整合的积极影响。另外，XPS 分析证实样品表面的化学成分发生了显著变化等离子处理后。与TNS 表面相比，大量的极性氧基团（例如羟基，羰基和羧基）在等离子处理后形成，这会增强其亲水性[35]，这与接触角实验的分析是一致的，从而确定等离子体-TNS 表面的亲水性得到了进一步改善。

同时，通过XPS 分析还显示了等离子体处理后NOx 的增加是由于等离子体产生了过多的气相RNS [38]。此外，在等离子体处理后，观察到碳的减少和RONS 的形成，并被认为与去污的有效性和抑制早期细菌附着和生物膜形成[39-42]。在血浆净化过程中，细菌直接暴露于由丰富的RONS 组成的血浆羽流中，这些RONS 会诱导膜改变和酶抑制作用，迅速改变膜转运蛋白，导致积累更多的RONS，最终导致生理功能障碍和细胞死亡[43,44]。

另外，去污实验的结果表明等离子处理的应用被生物膜污染的纳米结构表面可以有效地消除生物膜而无需破坏表面的纳米结构。此外，李等。证明等离子处理可以减少碳污染形成亲水性表面，从而提高抗性细菌附着并抑制生物膜的再定殖，从临床角度来看这将是非常有益的 [26]。

根据细胞粘附实验的结果，等离子处理未诱导细胞在培养的早期阶段，细胞凋亡甚至促进细胞附着[45]。细胞形态分析显示，经过等离子处理的表面有较高的细胞面积，这很可能会有助于提高等离子处理样品的亲水性[46]。此外，结果表明细胞增强了成骨分化能力，ALP 活性，钙沉积，骨形态发生蛋白2 和骨钙素基因表达。
同时，动物实验也显示，等离子处理有助于促进全面的新型骨生成和骨整合。根据显微CT，组织学切片和荧光标记分析，等离子处理会促进成骨。值得注意的是，等离子处理产生的表面强烈促进了新表面的产生。植入后第1 和第4 周的骨组织形成，有助于成骨并确认了植入物的稳定性。这些品质在早期植入成功中起着决定性的作用。植入，因此我们的研究结果将为将来利用这些技术的研究途径提供支持有前途的品质。

XPS 分析的结果表明，等离子体处理显著的改变了在表面上的化学成分组成，并且导致极性氧基团的增加（例如羟基，羧基等）。此外，我们更愿意研究这些附着在细胞等离子体处理的表面上增加的功能性氧气基团的影响。干细胞生物学研究在近数十年来，人们一直过度关注的细胞内ROS 积累会破坏蛋白质，脂质，DNA，最终导致细胞凋亡[47,48]，与此同时，已经阐明了多种干细胞的抗氧化和抗应激机制[49,50]。然而，有增加支持氧化还原动态平衡中细胞内ROS 在血管紧张素转换酶中起关键作用的观点的证据。在某些情况下保持干细胞的自我更新[51]。确实，
干细胞位于以细胞内ROS 水平低为特征的状态，这对调节自我更新和干枯的潜力，而高水平的细胞内ROS 有效地抑制了干细胞自我更新和分化的能力[52-54]。此外，根据上野等。
据报道，用紫外线光预处理的钛表面显着降低了细胞内ROS 和炎症细胞因子的表达，从而防止氧化应激诱导的DNA 损害并促进细胞粘附和扩散[55]。因此，调查之间的联系等离子处理后细胞内ROS 水平和化学性质的改变可能会提供一些见解进入等离子处理促进骨整合的机制植入。结果表明，附着在经过等离子体处理的表面的细胞显示出与未处理表面相比，细胞内ROS 水平较低，而成骨活性。最近，Gómez-Puerto 等人。已经证明氧官能团可以诱导丝氨酸294 上的叉头盒O3（FOXO3）磷酸化，这是由MAPK8 激酶及其易位至细胞核。同时激活了FOXO3 通过激活自噬以维持氧化还原而下调细胞内ROS 成骨细胞分化过程中的稳态[56]。此外，FOXO3 的过表达成骨细胞中的基因可以减少氧化应激和成骨细胞凋亡，并增加骨骼形成率[57]。我们假设经过等离子体处理的表面上的氧官能
团可能会激活FOXO3 的磷酸化从而下调氧化应激状态，这似乎成为等离子处理后增强成骨活性的可能机制之一。

将来将进行进一步的实验，以确认成骨活性是否更好在等离子处理的TNS 组中观察到的原因是由于氧气诱导的细胞内ROS 减少官能团介导的FOXO3 的磷酸化。
总而言之，证明了等离子体处理可以显着地促进增强成骨活性和进行表面净化。通过评估表面特征和生物膜去污，我们确认等离子体处理可以消除污染而又不破坏表面的有益纳米结构。以下体外和体内成骨活性实验的结果，我们还验证了表面等离子处理后对增强成骨细胞的分化和早期成骨活性。此外，由于出色的效果同时重建高度亲水的表面，适合骨整合和消除生物膜，并且等离子治疗的临床友好优势，例如手持式，操作平稳，成本低，等离子的广泛应用有望在近期之前成为一种有利的植入治疗方法或作为植入物周围炎的治疗策略。此外，这项研究表明等离子体
处理不会改变纳米结构表面的粗糙度，这对于这种等离子体处理和其他材料的组合应用具有重要意义与纳米结构。在未来的实验中，我们还将建立感染动物模型并全面评估了对被感染植入物进行等离子体处理的效率种植体周围炎的治疗策略。

4. 材料与方法

4.1. 样品制备

纯2 级钛合金圆盘（直径15 毫米，厚度1 毫米）和钛合金螺丝通过机械加工制备植入物（外径为1.2 毫米，长度为12 毫米）（Daido Steel，日本大阪，日本）分别评估表面特性和用于动物研究。然后用增量SiC 砂纸（800＃，1000＃和1500＃）对圆盘进行抛光。 所有样品分别用丙酮，乙醇和去离子水超声清洗（每次10 分钟），并在室温下干燥室温过夜。 将所有样品浸入30°C 的10 M NaOH 溶液中24 小时，用离子交换水（200 mL）洗涤几次，直到溶液的电导率达到5 S / cm3，然后在室温下干燥过夜，以建立多孔，均匀，钛表面上均匀的纳米网络结构（TNS）。

4.2. TNS 等离子处理

使用非热大气压手持式等离子体进行等离子体处理利用压电的装置（piezobrush®PZ2，relyon plasma GmbH，德国雷根斯堡）直接放电技术。一半样品在室温下用等离子体诱导处理在常压下用活性气体处理30 s。射流出口和样品之间的距离设置为5 mm 以确保样品完全浸入从喷嘴出来的等离子羽流中。
在实验组中测试了血浆处理过的TNS，而对照组未进行过测试。

4.3. 表面表征

通过SEM（S-4800，Shimadzu，Kyoto 日本）以10 kV 的加速电压。使用了AFM（SPM-9600，Shimadzu Co.，日本东京）分析平均平均表面粗糙度（Ra），平均峰谷高度（Rz），表面轮廓和样品的三维表面形貌。样品的化学成分为由XPS（日本岛津市Kratos Axis Ultra）确定。评估样品表面的润湿性使用接触角测量系统（VSA 2500 XE；AST Products，美国马萨诸塞州Billerica）。

4.4. 生物膜去污

从接种5 mL 胰蛋白酶大豆肉汤的单个菌落制备金黄色葡萄球菌培养物（TSB）培养基，并在37°C 下孵育16 小时。一毫升细菌悬浮液，通过添加新鲜的TSB 介质将其调节至1105 CFU / mL 的浓度，并添加至表面孵育24 小时后，会形成TNS，导致生物膜形成。然后，将细菌悬液除去，并准备样品，随后通过用磷酸盐冲洗进行等离子体处理用生理盐水（PBS）溶液去除不粘附的细菌。等离子处理后，样品将其转移到装有5 mL TSB 培养基的无菌试管中，涡旋2 分钟，清除形成的生物膜。溶液中细菌的定量通过板计数法[58]。

4.5. 细胞培养

从8 周龄Sprague-Dawley 大鼠（SHIMIZU）的股骨中获得rBMMSC 日本京都实验室用品有限公司）。 将细胞培养在含有少量微量元素的生长培养基中基本培养基（日本东京的Nacalai Tesque Inc。），10％胎牛血清（NacalaiTesque Inc.），和抗生素-抗真菌混合储液（Nacalai Tesque Inc.）在5％CO2 加湿的培养箱中在37 C. 每三天更换一次培养基。

4.6. 细胞形态

孵育24 小时后，将样品用PBS 洗涤，并通过与4％的孵育液进行固定多聚甲醛溶液20 分钟，用0.2％（v / v）Triton X-100 渗透30 分钟，与第一种封闭剂（日本京都的Nacalai Tesque）一起孵育30 分钟，然后染色用AlexaFluor 488-鬼笔环肽（Invitrogen / Life Technologies）和DAPI 在37°C 的黑暗环境中放置1 小时。共聚焦激光扫描显微镜（LSM700; Carl Zeiss）用于评估F-肌动蛋白和细胞贴壁细胞核。从三个代表性图像中随机选择总共30 个细胞根据最近的报告，每组中三个样品的每个表面均进行了测量。和ImageJ 软件用于荧光图像分析。

4.7. 细胞粘附

将rBMMSCs 以4 104 细胞/ cm2 的初始密度接种到标本上，允许附着1、3、6 和24 小时。在37°C 孵育后，去除非贴壁细胞通过用PBS（Nacalai Tesque，Inc.）洗涤并用300 L 稀释的CellTiter-Blue®培养试剂（在250 L PBS 中稀释
的50 LCellTiter-Blue®试剂）。再孵育1 小时后，荧光强度用酶标仪（SpectraMax M5; Molecular Devices，根据制造商的协议。

4.8. 细胞内ROS 的测定

利用氧化敏感荧光分析细胞内ROS 的产生探针2’，7′-二氯荧光素二乙酸盐（DCFH-DA，西格玛，美国密苏里州圣路易斯）。孵化后24 小时后，将细胞用PBS 洗涤，并与10mM DCFH-DA 在37℃温育30 分钟。然后，将细胞用PBS 洗涤两次，用50L 胰蛋白酶（0.25％）分离，并用50L PBS 稀释。然后使用荧光在激发/发射波长485/528 nm下测量荧光酶标仪，根据制造商的说明。

4.9. 碱性磷酸酶（ALP）活性

为了评估ALP 活性，将4 104 个细胞接种到标本上并在-MEM 中培养含有10％的胎牛血清，抗生素-抗真菌剂，10mM 甘油磷酸（Wako Pure 日本大阪化学工业公司）和10 nM 地塞米松（Nacalai Tesque）。差异化每3 天更换一次培养基。孵育7 或14 天后，将样品洗涤用PBS 溶解附着在样品表面的细胞，然后用300 L 的0.2％溶解海卫一X-100。通过碱性磷酸酶发光酶联法评估ALP 活性按照制造商的说明使用免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Sigma-Aldrich）。使用PicoGreen dsDNA 分析试剂盒（Invitrogen / Life Technologies）评估DNA 内容。将ALP 的量标准化为每种细胞裂解物中DNA 的量。

4.10. 细胞外基质矿化

孵育21 或28 天后，测量了钙在细胞外基质中的沉积用10％甲酸溶解后。钙含量定量和使用钙计算根据制造商的说明使用电子测试套件（和光纯药工业有限公司）。4.11。成骨相关基因表达使用实时TaqMan RT-PCR 分析评估成骨相关基因的表达（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司）。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，荷兰Venlo）和每个RNA 样本的10-L 等分试样反转录成利用Prime Script RT 试剂盒（TaKaRa Bio，Shiga，Japan）的cDNA。
的mRNA 水平骨形态发生蛋白2（Bmp 2）和骨γ-羧基的成骨相关基因使用Step One TM Plus RT-PCR 系统（LifeTechnologies）研究了含谷氨酸的蛋白质（OCN）。将各组的相对基因表达水平标准化为相对基因表达水平。3-磷酸
甘油醛脱氢酶（GAPDH）看家基因。

4.11.

4.12. 动物模型和手术程序

动物实验是根据《国家动物》的道德原则进行的护理指南，并经大阪牙科大学医学伦理委员会批准，日本（批准号19-06002，2019 年8 月16 日）。八周大的雄性Sprague-Dawley 大鼠（Shimizu 在这项研究中使用了180-200 g 的日本京都实验室用品有限公司。大鼠是随机分为两组，每组八只大鼠。本研究中使用的手术程序先前已有描述[59]。
全身麻醉和手术清洁后，纵向10 毫米沿右后腿膝盖关节内侧切开切口。 pat 骨和伸肌然后脱位，露出股骨远端。钻了一个1.2 毫米的孔a 间切口使用牙科去毛刺和无菌生理盐水冲洗。将螺丝植入准备好通道，恢复膝关节，并缝合切口。庆大霉素（1 mg / kg）术后三天注射丁丙诺啡（0.05 mg / kg）和丁丙诺啡，以防止术后感染并减轻术后疼痛。

4.13. 顺序荧光标记和微计算机断层扫描

通过腹膜内注射荧光染料对骨骼进行彩色连续标记用于确定新骨形成和矿化后的过程和特征根据以下时间表植入：向大鼠注射25 mg / kg 土霉素植入后1 周时用30 mg / kg 茜素红S 盐酸盐（Sigma-Aldrich，USA）（011-01192，Wako，JP）在第4 周时服用20 mg / kg 钙黄绿素（340-00433，Wako，Japan）在第8 周时服用。然后在第8 周将大鼠麻醉并安乐死，包括植入物在内的右股骨解剖后立即将其置于盐溶液中，并用SMX-130CT 扫描微计算机断层扫描（micro-CT）扫描仪（Shimadzu）在90kV 和40 A 下运行，铜过滤器。使用形态计量软件获得三维重建模型（TRI / 3D-BON； Ratoc 系统工程，日本东京）。感兴趣的区域定义为2 低于生长板最高点1 毫米，并围绕每个植入物延伸500 m。的骨体积分数（BV / TV），小梁平均数（Tb.N），小梁平均厚度（Tb.Th），量化平均小梁分离度（Tb.Sp）以评估骨再生。

4.14. 顺序标记切片的组织学

显微CT 扫描后，将8 周时收集的植入股骨染色，Villanueva 方法评估骨骼生成。所有组织形态和荧光特征使用BZ-9000 数字冷照明显微镜（Keyence Co.日本大阪）和激光扫描显微镜（卡尔·蔡司，德国Oberkochen）。盐酸土霉素的激发和发射波长为351/460 nm（蓝色），茜素红S（红色）的543/617 nm 和钙黄绿素（绿色）的488 nm / 517nm。骨头区域使用ImageJ 软件在植入物周围200 个视野中评估BIC 和标记的骨区域。

4.15. 统计分析

所有数据均表示为平均标准偏差。重复每个实验三遍，所有结果均通过Student t 检验在SPSS 26.0 中进行了比较；认为P <0.05 具有统计意义。

5. 结论

对纳米网络钛表面的等离子体处理有效地改变了样品表面化学成分的组成，进一步改善了植入物的亲水性并促进了细胞的附着和延伸； 大大加速了新骨的生成并在植入初期改善了骨整合。 此外，等离子体处理保留的纳米级形貌的同时有效的净化了TNS 表面，同时在植入物表面生成了有利于成骨的表面，可以用作一种新方法用于植入前即时治疗和种植体周围炎的治疗方法。
此外关于细胞粘附要阐明，等离子体处理对分化和去污的影响为将来的研究和开发基于等离子的治疗策略提供了有意义的建议。

作者贡献

A.A.，T.S.和S.K.构思并设计了实验； Y.Z.执行了实验； S.K.，H.N。和Y.Z.分析数据； J.O.贡献的试剂/材料/分析工具； Y.Z.写纸。所有作者均已阅读并同意该手稿的发行版本。

资金

这项研究得到了日本科学促进会的资助（19K19146 和18K09713）和大阪牙科大学研究基金（20-08）。

致谢

感谢大阪大学的Tohru Sekino 和Nishida Hisataka 准备了TNS 并提供有用的建议。我们感谢大阪牙科大学的Akinori Agariguchi 为有益的建议。我们还要感谢大阪工业科学研究所的小林康之森野宫技术中心提供有用的建议。
我们也感谢该部的成员可移动的修复牙齿和咬合以及牙周病科的建议和协助。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

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